1. )Предмет,задачи и методы фитопатологии,связь с др еление болезни,экономическое значение и типы проявления ы защиты.

1.)Предмет,задачи и методы фитопатологии,связь с др науками.Определение болезни,экономическое значение и типы проявления болезни.Методы защиты.

Фитопатология – это наука о болезнях растений (название происходит от греческих слов: phyton – растение, pathos – болезнь, logos – учение). Предметом фитопатологии является больное растение в связи с факторами, вызывающими болезнь и условиями, влияющими на ее развитие.

1-Поиск путей снижения ущерба от фитопатогенов

2-Изучить систему больное растение

3-Изучить причины появления болезни

4-Условия для развития болезни

5- Устойчивость растения.иммунитет. Массовое проявление болезней.

Связь с др-ми дисциплинами. Наука общебиологическая,связанна с другими дисциплинами этиология,иммунулогия,микробиология,вирусология,появился прогноз развития болезни ,защита растения от болезни.Фитопатология также связанна с агрохимией,экономикой.

Болезнь .Её сущность и проявление

Болезнь-это процесс,в основе кот-го лежит взаимодействие между раст-м ,болезнетворным агентом и условиями внешней среды .

Изменение в жизнедеятельности растения будут сопровождаться нарушением физиологич-х функций.Это патологический процесс,в результате которого образуется новая другая система –больное растение.

Современное определение болезни-по ГОСТУ нарушение норм-го обмена вещ-в клеток ,органов или целого растения под влиянием фитопатогена или неблаг-ых условий.Болезнь необходимо отличать от уродливости .

Экономич-е значение.Чтобы бороться с болезнями растений, приходится принимать дорогостоящие меры – профилактическое опрыскивание растений пестицидами. Большие средства тратятся на разработку химических средств защиты растений. Мировой ассортимент пестицидов (только по действующим веществам) насчитывает около 1000 наименований, а их использование обходится человечеству в 15,32 млрд.долларов в год (на 1990 г.). Расходы на защиту растений велики, но если бы их не было, то потери урожая увеличились бы, поменьшей мере, в 2 раза (без учета возможных эпифитотий). Во многих случаях знание биологии возбудителей болезни позволяет проводить профилактические мероприятия и сохранять урожай с меньшими затратами.

Типы проявления болезни.

Методы фитопатологии : специфические и неспецифические

1 (Специфический.)Макроскопический метод исследования –диагностика заболевания по внеш.признакам –симптомам.

2 Неспециф. Микроскопический –распознать ,диагностика морфологич-х признаков возбудителя

3.Спец.Серодиагностический метод –метод фитопатологии ,основанный на внесении сыворотки животного происхождения с кашитцей из больного растения методом сравнения (осадок ,цвет и т.д)

4.Специф. Индикаторных растений.для микроскопич-ой инфекции :вируса,вероиды микоплазмы,живет только в клетке живой и вырабатывает спец-ые признаки

5. Электронно-микроскопический метод-для опред-я микроскопич.морфологического строения болезни

6. Метод влажной камеры.(Неспециф.)

2.) Вирусы как возбудители

Инфекционные болезни растений, вызываемые вирусами, получили название вирозов. Вирусы — это ультрамикроскопические облигатные паразиты, характеризующиеся отсутствием клеточного строения, относительной простотой химического состава и способностью проходить через бактериальные фильтры. Они способны репродуцироваться в живых клетках восприимчивых растений и не способны накапливаться и проявлять активность вне организма. Впервые вирусы были открыты в 1892 г. известным русским ученым Д.И. Ивановским при изучении мозаики табака. Он по праву считается признанным основоположником учения о вирусах и вирусных болезнях. В настоящее время описано около 600 видов фитопатогенных вирусов. Размеры вирусных частиц весьма малы: в среднем около 200 нм. Химическое строение вирусов достаточно хорошо изучено. Вирусная частица состоит из одиночной или двойной нити нуклеиновой кислоты (почти всегда РНК), окруженной множеством симметрично расположенных молекул белка. Фитопатогенные вирусы могут размножаться только в живых клетках растений. Вне живых клеток вирусы теряют свою активность, но способны сохраняться в инактивированном (неактивном) состоянии в течение довольно длительного времени. Например, вирус табачной мозаики может сохраняться в сухом табаке до 50 лет. Вопрос о природе вирусов до сих пор не решен. По таким свойствам вирусов, как инфекционность, способность к размножению, паразитизму и сохранению наследственных признаков, их относят к живым организмам. В то же время многие вирусы способны вступать в реакции и кристаллизоваться, подобно минеральным соединениям. Активность вирусов зависит от факторов внешней среды: температуры, света, кислотности среды, различных химических веществ. По этому признаку И.Г. Семенкова и Э.С. Соколова подразделяют вирусы на стойкие и нестойкие.

Микоплазмы (фитоплазмы) — возбудители болезней растений открыты лишь в 1967 г. Их обнаружили японские учёные при помощи электронного микроскопа во флоэме растений шелковицы, поражённых карликовостью. Эти микоплазмоподобные организмы (МПО) оказались фитопатогенными. Было установлено что они передаются от растения к растению цикадками, листоблошками (ксиллидами) и повиликой и вызывают болезни, подобные «ведьминым мётлам» и желтухам. По свойствам МПО напоминают организмы, входящие в группу микоплазм. Однако в отличаи от микоплазм животных, обнаруживаемых обычно вне клеток, фитоплазмы были выявлены внутри клеток.

Установлено, что возбудителями большой группы болезней, подобных «ведьминым метлам» и желтухам, служат не вирусы, как считалось ранее, а фитоплазмы. К ним относят желтуху астр, желтую карликовость риса, столбур пасленовых, реверсию, или махровость смородины, позеленение плодов цитрусовых, курчавую мелколистность (карликовость) шелковицы, пролиферацию и мелкоплодность яблони, филлодии клевера, карликовость кукурузы и др. Всего описано более 50 фитоплазмозов, считавшихся ранее вирусными болезнями.

Фитоплазмы — специфическая группа фитопатогенных организмов, занимающих промежуточное положение между бактериями и вирусами. Они представляют собой полиморфные организмы. Клетки их, как правило, округлы, но некоторые имеют удлиненную или гантелеобразную форму. Один и тот же фитоплазменный организм может иметь клетки неодинаковых размеров и форм. Так, в клетках флоэмы столбурных растений табака присутствуют фитоплазмы сферической, овальной, вытянутой и другой формы. Диаметр клеток 0,1—1 мкм.

Фитоплазмы не имеют настоящей клеточной стенки, окружены трехслойной элементарной мембраной, чем и отличаются от бактерий. По сравнению с вирусами для них характерны клеточное строение и способность размножаться на искусственных питательных средах. На плотных средах они образуют мелкие специфические колонии, по виду напоминающие «яичницу-глазунью». В отличие от вирусных частиц, в клетках фитоплазм присутствуют два типа нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) и рибосомы, по размерам близкие к рибосомам бактерий. Фитоплазмы, в отличие от бактерий, устойчивы к пенициллину, но по сравнению с вирусами чувствительны к тетрациклину.

Фитоплазмы очень вредоносны. Пораженные растения часто вообще не дают урожая, или он резко снижается. Это объясняется тем, что при фитоплазмозах нарушается рост и развитие растений, наблюдается карликовость. Другой характерный симптом фитоплазменных болезней — патологические изменения генеративных органов, проявляющиеся в позеленении цветков (столбур пасленовых), в превращении отдельных их органов в листовидные образования (реверсия черной смородины, филлодия клевера и др.).

Многие симптомы, развивающиеся на растениях при заражении фитоплазмами, имеют специфичный характер и не возникают при заражении другими патогенами. К таким проявлениям фитоплазмозов относятся «ведьмины метлы», представляющие собой множество веретеновидных побегов, нитевидные ростки клубней картофеля. Симптомы филлодии клевера, реверсии черной смородины, столбура пасленовьгх и других заболеваний появляются, очевидно, в результате нарушения метаболизма растительных гормонов.

При фитоплазмозах появляются и такие симптомы, которые присущи вирусным инфекциям: неспецифичные деформации различных органов, увядание, некроз, мелколистность и др. На одном растении могут наблюдаться одновременно или последовательно: общий хлороз, антоцианоз, угнетение роста, деформация органов, увядание. Поэтому полное представление о болезни в таких случаях можно составить лишь после наблюдения за растением в динамике, т. е. в течение всего вегетационного периода.

Вирусы — исключительно мелкие объекты, размеры которых измеряются миллимикронами, поэтому обнаружить их возможно только через электронный микроскоп. Вирусы считаются живой формой, однако это оспаривается рядом ученых, считающих, что у вирусов недостает для характеристики “живое” ряда свойств. Размеры и формы вирусов серьезно отличаются, скажем, вирус некроза табака имеет сферической формы частицы диаметром около 30 ммк, а вирус табачной мозаики имеет палочковидную форму размером 15×280 ммк. В ряде случаев частицы вирусов имеют форму нитей и др. При совпадении условий вирусы могут принимать кристаллическую форму. Вирусы имеют в качестве составляющих соединения — белки и нуклеиновые кислоты, являющиеся обязательными компонентами любого живого организма. Данные соединения получаются вирусами в процессе использования находящихся в клетках растения-хозяина низкомолекулярных соединений. Вирусы получили исключительно широкое распространение в природе, к настоящему времени известно достаточно много видов вирусов, вызывающих инфекционные болезни у растений. Вирусы проникают в растение различными путями: через раны, возникающие, к примеру, в случае трения листа больного растения о лист здорового растения, при повреждении клеток растения вредителями и так далее. Вирусы, проникая в растение, размножаются в клетках эпидермиса или паренхимы. В ряде случаев вирусы размножаются в более глубоких тканях растений, включая в том числе и ядра клеток. В случае возникновения вирусного заболевания у больного растения начинаются различные патологические изменения: идет нарушение обмена веществ, углеводный и водный обмен и так далее. Эти изменения вызывают подавление роста растения в целом либо его отдельных частей: листьев, ветвей, а также различные деформации листьев, побегов. Чаще всего вирусные заболевания переносятся на растение насекомыми-вредителями, имеющими колюще-сосущий ротовой аппарат. При питании насекомого соком больного растения и происходит заражение его вирусными заболеваниями. Способ переноса и сохранения инфекции К самым обычным распространителям вирусов относятся нематоды,тля,трипсыичервецы. Также распространенным путем передачи вирусных болезней является вегетативное размножение заболевших растений. При семенном размножении передачи вирусов обычно не имеется. Однако в ряде случаев, к примеру, у косточковых и бобовых растений, идет передача вирусных заболеваний и путем семенного размножения. Растения, заболевшие после цветения, способны давать здоровые семена, а растения, заболевшие в ранних стадиях развития цветка, уже могут передавать вирусы. Некоторые вирусы способны передаваться от больных растений здоровым по почве, например, нематодами или при непосредственном контакте поврежденных корней со здоровыми. Обычно симптомы поражения растений вирусными заболеваниями разделяются на две основные группы:мозаикаижелтуха. Дляжелтухихарактерно изменение нормальной окраски листьев и всего растения в целом. Листья становятся светло-зелеными, желтыми или почти белыми. Также появляются некрозы, которые вызывают скручивание листовой пластинки, недоразвитость и изменение окраски у цветков заболевшего растения. Длямозаикихарактерно появление на листьях и стеблях растения пятен, точек и полос различного цвета, формы и величины, которые разбросаны группами по листовой пластинке. В случае отсутствия границ у хлоротичных пятен на ткани листа это проявление вирусного заболевания называется имеет название крапчатость. Часто наблюдается и осветление прилегающих к жилкам тканей. Также идет скручивание листьев вниз, вверх, спирально от первоначальной формы. При некоторых вирусах наблюдается курчавость листьев, т. е. деформация в результате неравномерного разрастания отдельных участков листовой пластинки. Также для вирусов часто характерны чрезмерное ветвление и укорочение междоузлий растения. Встречаются различные по цвету, форме и величине некрозы, в форме пятен на листьях. С течением заболевания некрозы становятся сквозными. Также одними из симптомов вирусных заболеваний могут являться утолщение и растрескивание стебля, превращение лепестков и тычинок цветков в листья и так далее.

Меры борьбы: использование иммунных сортов; регулирование сроков сева и уборки [например, в южных областях ранние сорта картофеля при ранней посадке и ранней (в июле) уборке наименее поражаются вирусами]; прочистка семенных участков от больных растений; борьба с переносчиками и сорняками, прогревание окулировочного материала, другие специальные мероприятия.

Фитопатология

Фитопатология (фито — растение и патология) — наука о болезнях растений, вызванных патогенами (инфекционные болезни) и экологическими факторами (физиологические факторы). Включает разработку средств борьбы с заболеваниями, профилактику поражения растений.

Содержание

История

Ещё в цивилизациях Древней Греции и Древнего Рима имелись понятия и описания ржавчины, головни, рака деревьев и других болезней.

Фитопатология в СССР

Разделы фитопатологии

Фитопатология основана на данных анатомии и физиологии растений, микробиологии, микологии, генетики, селекции и растениеводства. На основе фитопатологических исследований в сельском хозяйстве строится система защиты растений от вредителей и болезней.

Общая фитопатология

Объектом общей фитопатологии являются:

• возбудители болезней, причины и условия их возникновения,
• закономерности развития, распространения, массовых вспышек (эпифитотий)
• общие анатомо-физиологические изменения в больных организмах
• иммунитет и карантин растений
• организацию службы защиты растений от вредителей и болезней
• подготовку прогнозов появления болезней
• средства и методы защиты растений

Частная фитопатология

Частная (специальная) фитопатология исследует болезни сельскохозяйственных культур.

Лесная фитопатология

Наука о болезнях деревьев и кустарников, о разрушениях мёртвой древесины.

Фитопатология декоративных растений

Инфекционные заболевания

Грибы

Оомицеты

Бактериальные заболевания

Среди бактерий есть и некоторые фитопатогенные виды, например Agrobacterium tumefaciens вызывает образование так называемых «корончатых галлов» и бактериального рака у двудольных растений, Pseudomonas syringae вызывает бурое слизеточение, обморожения, повреждения плодов и пятнистость листьев растений, бактерии рода Erwinia вызывает болезни картофеля и других растений, называемые чёрная ножка (подвид E. carotovora subsp. carotovora) и мягкую гниль (подвид E. carotovora subsp. atroseptica). E. carotovora subsp. carotovora развивается при температуре ниже 18 °C и вызывает симптом «чёрных чернил», в то время как E. carotovora subsp. atroseptica — выше 18 °C и данного симптома не вызывает.

Вирусы, вироиды, и вирусоподобные организмы

Вирусы — это мельчайшие (субмикроскопические) возбудители болезней растений, человека и животных. Вирусная частица (вирион) большинства фитопатогенных вирусов имеет палочковидную или нитевидную форму, но могут быть округлые, сферические, многогранные и другие. По химическому составу вирусы являются нуклеопротеидами, то есть они состоят из белка и одной нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК). Отмечено, что большинство фитопатогенных вирусов содержит, как правило, РНК (рибонуклеиновая кислота), но некоторым вирусам свойственно наличие ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота). Нуклеиновая кислота занимает в вирусной частице центральную часть, представляя собой нечто вроде спирали, на которую нанизывается множество симметрично расположенных молекул белка, (рис.32.). Нуклеиновая кислота занимает в вирусной частице всего около 5 % в палочковидных вирусах (вирус табачной мозаики), в сферических-17-35 % (вирус мозаики фасоли, желтой мозаики турнепса и др.). Остальная часть вирона −65-95 % состоит из белков, в состав которых входит 20 аминокислот. Белковая оболочка окружает и защищает нуклеиновую кислоту, которая является носителем инфекции и наследственных свойств. Вирусы живут и размножаются (реплицируются) только в живой клетке, образуя подобные себе новые вирусные частицы. Попав в клетку растения — хозяина, нуклеиновая кислота освобождается от белковой оболочки, реплицируется (размножается), начинается синтез новой нуклеиновой кислоты и вирусного белка, в результате собираются новые вирусы. Они могут перемещаться из клетки в клетку по плазмодесмам или по сосудистой системе. В растительной клетке нарушается естественный ход обмена веществ, в частности, функция хлоропластов, ростовые процессы и т. д. В растение вирусы могут проникать только через поврежденную растительную ткань: механически в процессе ухода за растениями (пасынкование, черенкование, прищипка и др.) или с помощью насекомых колюще-сосущего типа (тли, цикадки, клопы, трипсы). Насекомые же являются основными переносчиками вирусов от растения к растению, и механизм передачи может быть механическим или биологическим путем. При механической передаче насекомое, питаясь на больном растении и загрязняя вирусом свой ротовой аппарат (кончик стилета), может сразу же перенести вирусную инфекцию на другое растение. Такой перенос осуществляется тлями. Биологический путь- это когда насекомое становится носителем вирусов, то есть вирус, попадая в организм, проходит скрытый период развития и переходит из пищевода в слюнные железы. Насекомое становится способным передать инфекцию не сразу после питания на больном растении, а по истечении какого-то времени. Чаще всего такой путь характерен для цикадок, реже тлей, трипсов, клопов, клещей. В период вегетации вирусы могут передаваться от растения к растению человеком во время пасынкования, чеканки, прищипки, когда сок с больного вирусной инфекцией растения попадает через ранки в здоровые пастения. Сохраняются вирусы в организме насекомого, переносчика вируса, или в семенах, клубнях, корнеплодах, луковицах, редко в растительных остатках (ВТМ). Вирусы — облигатные паразиты, среди них встречаются узкоспециализированные, например, вирус зеленой мозаики огурца поражает только огурец и немногие виды семейства тыквенных. В то же время есть вирусы, поражающие растения из разных биологических семейств. Признаки вирусных болезней очень разнообразны, чаще всего встречаются: изменение окраски (мозаичная расцветка листьев), деформация органов (морщинистости, скручивание), задержка роста (карликовость), некрозы (полосчатая пятнистость, стрик), нарушение репродуктивных органов (стерильность, бессемянность, опадение цветков и завязи) Вирусные болезни не вызывают гибели растений, но, угнетая больное растение, они вызывают снижение его продуктивности, иногда до 100 К». Вред проявляется в снижении урожая и ухудшении качества продукции: снижается сахаристость корнеплодов сахарной свеклы, падает содержание крахмала в клубнях картофеля и т. д. Основными мероприятиями по защите растений от вирусных болезней следует считать использование безвирусного посадочного материала, возделывание вирусоустойчивых сортов и борьбу с переносчиками вирусов. Важное значение имеют противовирусные прочистки, то есть удаление больных растений на семенных участках картофеля, овощных и других культур; уничтожение сорных растений — резерваторов вирусных инфекций; соблюдение оптимальных сроков сева, густоты стояния растений.

Диагностика болезней растений и современные технологии

Обзор

Иллюстрация с обложки книги Ю.Т. Дьякова «О болезнях растений»

Автор

Редакторы

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Фитопатология — это наука о болезнях растений, о том, как с этими недугами бороться и предупреждать их возникновение. Чтобы побеждать болезни, надо их правильно, точно и своевременно диагностировать. Есть много методов такой диагностики; в последние десятилетия, с развитием молекулярных методов анализа, активно разрабатываются всё новые и новые, постепенно вытесняя из практики классические подходы. О трудностях диагностики болезней растений и об основных путях их преодоления и будет рассказано в этой статье.

Конкурс «био/мол/текст»-2013

Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2013 в номинации «Лучший обзор».

Спонсор конкурса — дальновидная компания Thermo Fisher Scientific. Спонсор приза зрительских симпатий — фирма Helicon.

Чем болеют растения?

Для начала несколько слов о том, от чего, собственно, специалистам приходится защищать сельскохозяйственные растения. Причинами заболевания растений могут быть как факторы среды (летняя засуха или зимние морозы, недостаток питательных веществ в почве или их избыток и т.п.), так и различные паразитические организмы (бактерии, вирусы, грибы, круглые черви (нематоды) и даже другие растения).

Грибы, бесспорно, являются основными патогенами культурных растений. Известно, например, что из 162 серьёзных заболеваний в Центральной Европе 135 (83%) вызываются грибами [2]. Фитопатогенные грибы — многочисленная группа; их описано свыше 10 000 видов, различных по систематическому положению, степени паразитизма, специализации и т.д. [3]. Они широко распространены в природе и при благоприятных для их развития условиях наносят значительный урон урожаю и сельскохозяйственным продуктам при хранении. Даже самые осторожные оценки говорят об уничтожении болезнями 10–20% потенциального урожая; без контрмер масштабы этих потерь резко возросли бы [2].

Именно о проблемах диагностики болезней растений, вызываемых фитопатогенными грибами, пойдёт речь в данной статье.

Врага надо знать в лицо

Зачем же нужно, с одной стороны — обнаружение, а с другой — быстрое и точное (желательно — до вида, или даже расы) определение фитопатогенных грибов?

На данный момент самым распространённым методом борьбы с фитопатогенными грибами является обработка растений фунгицидами. Понятно, что невозможно защитить культуры от всех возможных потенциальных угроз: это и сложно, и экономически невыгодно, да и для окружающей среды далеко не полезно. Именно поэтому важно знать, желательно — своевременно, с чем именно придётся бороться. Чем раньше обнаружена болезнь, тем больше шансов, что, приняв соответствующие меры, удастся её победить. Это верно для заболеваний как человека, так и растений. Кстати, точное определение вида грибов важно ещё и в довольно неожиданной области — реставрации деревянных строений — поскольку используемые там антисептические меры также очень сильно зависят от типа поражения [4].

Кроме этого, идентификация фитопатогенных грибов необходима для изучения их таксономии и эволюции, их взаимоотношений с растениями-хозяевами, генетических основ восприимчивости и устойчивости растений, что, в конечном счете, должно помочь в разработке способов борьбы с патогенами и в селекции растений, невосприимчивых к болезням [5].

И, наконец, крайне важна сертификация зерна и посадочного материала в рамках карантинных программ. Известно, что фитопатогенные грибы могут распространяться многими путями — как естественными (с током воздуха, водой, насекомыми, животными), так и при помощи человека, перевозящего заражённые растения или их части не только между различными странами, но и между континентами. Зачастую такое перемещение приводит к неожиданному и масштабному распространению заболеваний.

Например, пузырчатая ржавчина (Cronartium ribicola) была эндемична для Альп и востока России. Этот паразит, в цикле развития предполагающий обязательную смену хозяев, обитает круглый год на пятихвойных соснах, а летом поражает листья смородины; ни в одном из исходных ареалов он не причинял серьёзного ущерба. Однако веймутова сосна, завезённая в начале XVIII века из Америки в ряд областей Европы, оказалась крайне восприимчивым хозяином для данного гриба. За счёт этого распространившаяся инфекция причинила большой вред культурам смородины и высаженным веймутовым соснам, а в 1909 году была завезена с их рассадой в Америку, где встретила многочисленных хозяев для обеих фаз развития. Здесь стали страдать, прежде всего, лесообразующие пятихвойные сосны. Поэтому, чтобы разорвать инфекционную цепь паразита с обязательной сменой хозяев, пытаются уничтожать дикорастущие виды смородины [2].

Ещё один показательный пример: возбудитель голландской болезни вяза (Ophiostoma ulmi) уже в XX столетии был занесён из континентальной Европы в Северную Америку. Начиная примерно с 1970 г., после того, как он был завезён в Великобританию, он успел уничтожить половину английских вязовых насаждений [2]. Теперь этот вид встречается и в России.

Для того чтобы избежать подобного впредь, созданы списки карантинных организмов, и при перемещении растений или их семян между странами (или даже частями одной страны) обязательно проводится их обследование.

«Классические» методы диагностики и трудности в их применении

Как только что было показано, идентификация фитопатогенных грибов крайне важна, возник вопрос — каким образом она производится?

Наиболее простой способ — это идентификация патогена по внешним признакам заболевания (симптомам), то есть по тому воздействию, которое он оказывает на поражённое растение [6]. Но здесь проблема в том, что к одним и тем же повреждениям растения-хозяина могут приводить совершенно разные микроорганизмы, отличающиеся разной устойчивостью к фунгицидам, вредоносностью и другими характеристиками. Как пример, здесь можно привести три листовые пятнистости пшеницы (рис. 1).

Рисунок 1. Листовые пятнистости пшеницы. Слева — септориоз листьев пшеницы (возбудитель — Mycosphaerella graminicola). По центру — септориоз листьев и колоса пшеницы, проявление на листьях (возбудитель — Phaeosphaeria nodorum). Справа — жёлтая пятнистость пшеницы (возбудитель — Pyrenophora triticirepentis). Обратите внимание: несмотря на то, что это разные заболевания, поражения листьев очень похожи.

Ещё одна проблема заключается в том, что далеко не все заболевания проявляются сразу же после заражения растения. Например, возбудитель пыльной головни ячменя (Ustilago nuda) обычно проникает во время цветения пшеницы в формирующуюся зерновку. Гриб не препятствует формированию зародыша, само зерно развивается нормально, ничем внешне не отличаясь от здорового. Мицелий зимует в зерновке. Весной одновременно с прорастанием семян происходит и рост мицелия, который по мере роста растения распространяется по различным его органам. Проявляется заболевание только в период колошения. При этом разрушаются все части колоса, превращаясь в чёрную споровую массу, после распыления которой остаются лишь ости и стержень колоса (рис. 2) [8].

Рисунок 2. Пыльная головня ячменя: поражённое соцветие со спорами

Стандартный для фитопатологов подход при определении фитопатогенных грибов — это выделение их в чистую культуру на какой-либо питательной среде, получение характерных образований (чаще всего это, конечно, спороношения) и затем идентификация гриба под микроскопом.

Но здесь возникают определённые трудности. Основная из них заключается в том, что далеко не все паразитические грибы возможно культивировать на искусственных питательных средах: многим требуется наличие живых тканей растения-хозяина, либо присутствие других представителей сложного сообщества [10]. Но даже если гриб удаётся выделить в культуру, следующий вопрос — это то, сколько времени понадобится, чтобы добиться от него появления спороношения. Например, возбудитель белосоломенной болезни пшеницы и ржи (Gibellina cerealis), хотя и хорошо культивируется, даёт спороношение только после четырёх–пяти недель роста. Естественно, что меры по борьбе с патогеном необходимо принимать сразу после его обнаружения, а не через месяц, когда может оказаться, что спасать уже нечего.

Рисунок 3. Сравнение конидий типовых образцов Alternaria longipes (вверху), Alternaria tenuissima (в центре), Alternaria alternata (внизу). Видно, что на основе сравнения только формы конидий этих трёх видов однозначно различить их крайне сложно. При идентификации видов в данном случае специалист использует не только форму конидий, но и другие признаки (например, способ образования конидий, их взаимное расположение и т.п.).

И даже с определением тех фитопатогенных грибов, спороношения которых получить сравнительно просто, могут возникать сложности. К примеру, идентификация многих микромицетов сопряжена с рядом трудностей, таких как сходство морфологических характеристик разных видов и одновременно внутривидовая вариабельность признаков. Несмотря на внешнее сходство, возбудители могут значительно отличаться по патогенности, токсигенности, степени специализации, генетике взаимоотношений с растением-хозяином, вредоносности, чувствительности к фунгицидам и т.д. То есть разные виды обладают совершенно разными экологическими особенностями и хозяйственной значимостью [12]. Хорошим примером здесь является определение различных видов рода Alternaria (рис. 3). Очевидно, что для идентификации до вида нужны достаточно широкие познания в данной области и немалый опыт работы с исследуемым фитопатогеном.

Ещё один способ, пригодный для обнаружения некоторых фитопатогенных грибов, заключается в смыве с субстрата, фильтрации и микроскопическом определении (и даже подсчёте, что даёт количественные данные) их спор. Чаще всего, таким способом оценивается количество грибных спор в зерне или в почве. Несмотря на то, что идентификация до вида на основании одних только спор чаще всего затруднена, этот способ широко применяется, а для анализа получаемых при помощи микроскопа изображений разрабатываются специальные компьютерные программы [14]. Например, таким образом определяют заражённость зерна возбудителем твёрдой головни (Tilletia caries) (рис. 4) [15]. Несмотря на использование компьютерных технологий, этот метод весьма трудоёмок и не подходит для исследования большого количества образцов.

Рисунок 4. Зерновки, поражённые твёрдой головнёй пшеницы

Молекулярная биология на службе фитопатолога

Во всех описанных случаях на помощь исследователям могут прийти широко развивающиеся в последнее время молекулярные методы анализа. Сейчас в основе большинства из них лежит применение ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, иммуноферментный анализ) [11], либо ПЦР (полимеразная цепная реакция, polymerase chain reaction) [17].

Иммуноферментный анализ состоит из двух основных этапов: иммунной и ферментативной реакций. Иммунная реакция заключается в специфическом связывании характерного для данного микроорганизма антигена с диагностическим антителом. Ферментативная реакция необходима для обнаружения этого связывания. Как правило, она сопровождается изменением цвета, причём степень этого изменения может быть использована для определения количества присутствующего антигена.

Есть много модификаций данного метода, бóльшая часть из которых применяется для обнаружения возбудителей болезней растений [16]. Особенно интересен так называемый «lateral flow assay» (анализ капли, растекающейся в радиальном направлении) (рис. 5), отличающийся высокой скоростью анализа и не требующий никакого специального оборудования или знаний. Используя такой набор (имеющий карманный формат), можно провести анализ непосредственно «в поле», так что не нужно даже отправлять образцы в лабораторию.

Рисунок 5. Прибор CSL Pocket Diagnostic TM lateral flow immunodiagnostic kit. Растительный экстракт помещается на площадку (a), которая содержит латексные шарики, покрытые специфическими антителами; смесь мигрирует вдоль мембраны (b) к абсорбирующей поверхности (c). При этом имеющиеся в растворе целевые антигены связываются со специфичными антителами на латексных шариках. Мембрана содержит полосу антител, отличающихся необходимой специфичностью (измерительную полосу) (d) и полосу других антител, которые связываются с первыми антителами (контрольную полосу) (e). Латексные шарики, содержащие связанный антиген, задерживаются в тестовой зоне, давая видимую линию, тогда как излишние латексные шарики, которые не содержат антигена, задерживаются в контрольной зоне, показывая, что анализ работает. Наличие двух линий соответствует положительному результату (positive), наличие только одной линии (контрольной) говорит о негативном результате (negative).

Основанные на иммуноферментном анализе методы широко применяются для обнаружения вирусов (в том числе поражающих растения) и значительно реже — для идентификации грибов и бактерий. Основной причиной этого является трудность получения антител с необходимой специфичностью: строение клеточных стенок грибов и бактерий гораздо сложнее, чем вирусного капсида, к тому же может изменяться в ходе их жизненного цикла. В результате получаемые антитела могут оказаться специфичны как сразу к большой группе видов, так и исключительно к отдельным жизненным формам данных микроорганизмов. Тем не менее, основанные на ELISA методы идентификации фитопатогенных грибов всё же разрабатываются: например, существует метод идентификации спор уже упоминавшейся в данной статье твёрдой головни [19].

ПЦР — это ферментативная реакция, в результате которой происходит накопление большого количества копий какого-либо не слишком большого (чаще всего, 200–1500 пар нуклеотидов) фрагмента ДНК. Так как ДНК любого организма содержит как вариабельные (отличающиеся даже у близкородственных организмов), так и консервативные (сходные у эволюционно далёких видов) участки, возможно на основе выбора диагностического участка варьировать специфичность протекающей реакции.

Таким образом, данный метод позволяет обнаруживать последовательности нуклеиновой кислоты, специфичные для конкретного организма или группы сходных организмов и, тем самым, выявлять его (их) присутствие в анализируемой пробе. Методы, основанные на ПЦР, позволяют идентифицировать патогенные виды как в чистой культуре, так и непосредственно в растительном материале, минуя этап изоляции грибов [20]. Как пример, здесь приведены результаты ПЦР, разработанной для идентификации грибов рода Pyrenophora (рис. 6), представители которого являются возбудителями жёлтой пятнистости злаков, в частности — пшеницы (рис. 1).

Рисунок 6. Разделённые при помощи электрофореза продукты ПЦР, разработанной для идентификации грибов рода Pyrenophora. М — маркер, представляющий собой набор фрагментов ДНК известного размера, 1–10 — ДНК, выделенная из различных образцов листьев пшеницы, поражённых листовыми пятнистостями. Здесь продукт реакции (фрагмент ДНК известного размера) должен наблюдаться только в том случае, если в образце присутствует ДНК целевого организма, а именно — гриба рода Pyrenophora. В итоге видно, что растения под номерами 3–6, 8 и 9 больны жёлтой пятнистостью, а остальные — каким-либо другим внешне схожим заболеванием.

Существует достаточно много модификаций метода ПЦР, большинство из которых применяется в изучении возбудителей болезней растений. Например, RAPD и RFLP анализы используются для уточнения родственных связей между различными грибами; ПЦР, специфичная для ДНК представителей отдельных родов или видов — для идентификации фитопатогенов (в том числе — в форматах nested и multiplex); ПЦР с регистрацией в режиме реального времени (real-time PCR) — для определения количества присутствующей целевой ДНК.

Рассмотрим подробнее один из самых перспективных методов на основе ПЦР — ПЦР с регистрацией в режиме реального времени (рис. 7). В отличие от большинства других форматов ПЦР, он позволяет не только констатировать факт присутствия ДНК целевого патогена, но и измерить её количество. В качестве примера здесь приведено определение в двух образцах количества ДНК ещё одного возбудителя листовой пятнистости.

Рисунок 7. ПЦР с регистрацией в режиме реального времени. В ходе реакции непрерывно измеряется флуоресценция пробы (Fluorescence Signal), которая увеличивается по мере накопления продукта реакции (время реакции здесь выражено в числе циклов реакции — Cycle Number). Чем больше целевой ДНК было в смеси на момент начала реакции, тем быстрее происходит накопление продукта, и, соответственно, тем меньше будет номер цикла (cycle threshold, C_t), при котором флуоресценция пробы достигнет порогового значения (Detection threshold). Количество ДНК в исходной пробе определяют по калибровочному графику (приведён на вставке), соотносящему исходное количество целевой ДНК (Quantity) со значениями C_t. В данном случае на графике показано изменение во времени флуоресцентного сигнала для двух образцов, содержащих ДНК Mycosphaerella graminicola (рис. 1), причём кривая «а» соответствует образцу с большей концентрацией.

Интересно применение данного метода для анализа заражённости зерна твёрдой головнёй (рис. 4): при наличии соответствующих калибровочных графиков возможно получение результатов в виде числа спор, имеющихся в образце [7].

Ложка дёгтя в бочке мёда

Хотя преимущества и перспективы применения молекулярных методов идентификации сложно переоценить, на пути их практического использования имеется целый ряд трудностей. Несмотря на универсальность методов при конечном анализе, для их разработки и проверки требуется достаточно много времени и немалая экспериментальная база. Основной проблемой здесь является отсутствие возможности чисто теоретически оценить специфичность разрабатываемых методов.

Ещё одна сложность является прямым следствием высокой чувствительности данных методов (особенно — основанных на ПЦР). Ведь если анализ позволяет выявить в образце присутствие даже одной споры фитопатогенного гриба, или всего лишь нескольких копий его ДНК, то и для получения ложноположительного результата оказывается достаточно даже минимального загрязнения изначально «чистого» образца. Следовательно, требования к стерильности оказываются крайне высоки на всех стадиях анализа, но всё равно всегда приходится использовать отрицательные контроли.

Ну и самая большая проблема всех описанных в данной статье методов — это цена, ограничивающая их широкое применение в условиях небогатых российских хозяйств.

Несколько слов о будущем

Несмотря на все имеющиеся проблемы, молекулярные методы анализа интенсивно развиваются (о чём можно судить хотя бы по числу публикаций на соответствующие темы, которое с каждым годом становится всё больше). Старые методы постоянно совершенствуются, в то же время разрабатываются новые (например, метод биочипов [21] и секвенирование следующего поколения [22]), а цена одного анализа становится всё ниже. Поэтому можно надеяться, что не за горами то время, когда все упоминавшиеся в данной статье методики и их более совершенные аналоги действительно найдут широкое применение и облегчат жизнь фитопатологов и агрономов.

Источник https://studfile.net/preview/5051355/

Источник https://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/327212

Источник https://biomolecula.ru/articles/diagnostika-boleznei-rastenii-i-sovremennye-tekhnologii